PCR基因擴(kuò)增儀是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中用于體外擴(kuò)增特定DNA片段的核心設(shè)備。其操作需嚴(yán)格規(guī)范以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。PCR實(shí)驗(yàn)的核心是通過(guò)溫度循環(huán)(變性、退火、延伸)實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，具體步驟可分為實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、上機(jī)運(yùn)行和結(jié)果分析三部分。
1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
-模板DNA提取與定量：
從樣本(如細(xì)胞、組織、血液等)中提取基因組DNA或RNA(若為RT-PCR需先反轉(zhuǎn)錄為cDNA)。提取后通過(guò)分光光度計(jì)(A260/A280比值)或熒光定量法(如Qubit)檢測(cè)DNA濃度與純度，確保模板質(zhì)量(無(wú)降解、無(wú)抑制物)。
-引物設(shè)計(jì)合成：
根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(長(zhǎng)度18-25bp，GC含量40-60，避免二級(jí)結(jié)構(gòu))，并通過(guò)BLAST驗(yàn)證特異性。引物需用無(wú)菌TE緩沖液溶解至工作濃度(通常10μM/L)。
-加樣與防污染：
將反應(yīng)液分裝至PCR管(或八連排管)，蓋緊管蓋(避免蒸發(fā))。操作需在生物安全柜或超凈臺(tái)中進(jìn)行，使用帶濾芯槍頭，防止氣溶膠污染(尤其是陽(yáng)性對(duì)照或高拷貝模板)。
2.上機(jī)運(yùn)行程序
根據(jù)擴(kuò)增目標(biāo)(片段長(zhǎng)度、引物特性)設(shè)置溫度循環(huán)參數(shù)，典型程序如下：
-預(yù)變性：94-98℃(常用95℃)，2-5分鐘(使DNA解鏈，激活熱啟動(dòng)酶)。
-循環(huán)階段(25-40次)：
-變性：94-98℃，15-30秒(破壞雙鏈DNA)；
-退火：50-65℃(根據(jù)引物Tm值計(jì)算，通常Tm-5℃)，15-30秒(引物結(jié)合模板)；
-延伸：72℃，時(shí)間按片段長(zhǎng)度調(diào)整(1kb/分鐘，不超過(guò)5分鐘)。
-終延伸：72℃，5-10分鐘(確保所有片段延伸)。
-保存：4℃(短期保存)或終止程序(長(zhǎng)期保存)。
3.結(jié)果分析
-電泳檢測(cè)：取5-10μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1-2瓊脂糖凝膠電泳(電壓100-150V，20-30分鐘)，紫外燈下觀察目標(biāo)條帶(與Marker對(duì)比判斷大小)。
-實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)：若使用熒光染料(如SYBRGreen)或探針(如TaqMan)，可通過(guò)儀器自帶軟件分析擴(kuò)增曲線、熔解曲線(驗(yàn)證特異性)及Ct值(定量模板初始濃度)。
PCR基因擴(kuò)增儀的優(yōu)點(diǎn)：
1.高效性：傳統(tǒng)方法數(shù)天的工作可在幾小時(shí)內(nèi)完成，提升研究效率。
2.高靈敏度：能將極微量DNA(如單個(gè)拷貝)擴(kuò)增至可檢測(cè)水平，適用于痕量樣本分析。
3.強(qiáng)特異性：通過(guò)引物設(shè)計(jì)準(zhǔn)確靶向目標(biāo)序列，減少非特異性擴(kuò)增。
4.操作簡(jiǎn)便：自動(dòng)化程序控制取代復(fù)雜手工操作，降低技術(shù)門(mén)檻。
5.應(yīng)用廣泛：從基礎(chǔ)科研到臨床診斷(如傳染病檢測(cè))、法醫(yī)學(xué)鑒定等領(lǐng)域均有重要價(jià)值。
返回列表
更新時(shí)間：2026-01-14
更多推薦
